生產(chǎn)商          產(chǎn)品名稱                                        產(chǎn)品編號         產(chǎn)品規(guī)格
PeproTech 重組人Flt-3 Ligand (Animal Free)    AF-300-19 10ug/50ug/100ug/250ug/500ug/1mg
PeproTech 重組人IL-7 (Animal Free)      AF-200-07 10ug/100ug/250ug/500ug/1mg
PeproTech 重組人IL-15 (Animal Free)    AF-200-15 10ug/100ug/250ug/500ug/1mg
PeproTech 重組人SCF (Animal Free)       AF-300-07 10ug/50ug/100ug/250ug/500ug/1mg
PeproTech
(BioGems)  人CD28 激發(fā)型單抗 (極低內(nèi)毒素)   (克?。篊D28.2)    10311-25 100ug/500ug

生產(chǎn)商         產(chǎn)品名稱                     產(chǎn)品編號          產(chǎn)品規(guī)格        使用濃度
PeproTech 重組人IFN-γ (Animal Free) AF-300-02 100ug/250ug/500ug/1mg 50ng/ml
PeproTech 重組人IL1-α (Animal Free) AF-200-01A 10ug/100ug/250ug/500ug/1mg 0.1ng/ml
PeproTech 重組人IL-2 (Animal Free) AF-200-02 50ug/100ug/250ug/500ug/1mg 30ng/ml
PeproTech (BioGems)    人CD3 激發(fā)型單抗 (極低內(nèi)毒素)  (克隆：OKT-3)05121-25 100ug/500ug 50ng/ml

注：Animal Free 意為無動物成分。無動物成分的重組細胞因子在生產(chǎn)過程中不會有任何動物源性物質(zhì)，尤其是牛蛋白
的混入，使得zui終獲得的重組人蛋白中不含任何動物成分。這樣可避免動物病原體(如瘋牛病，克雅氏病等)的污染
及外源蛋白引起的機體異種排斥和過敏反應(yīng)，因此細胞治療的體外細胞培養(yǎng)過程中使用無動物成分的重組細胞
因子。

【參考文獻】
[1] Li R, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer:
a phase II clinical study. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:2125–2133

CIK 細胞的制備方法:

【背景】
CIK 是“Cytokine-Induced Killer Cells"的縮寫，中文全稱為“細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞"。
CIK 是單個核細胞在CD3 單抗和多種細胞因子(包括IFN-γ, IL-2 等)的作用下培養(yǎng)獲得的一
群以CD3+CD56+細胞為主要效應(yīng)細胞的異質(zhì)細胞群， 其既具有T 淋巴細胞強大的抗腫瘤活
性，又具有NK 細胞(自然殺傷細胞)的非MHC(主要組織相容性抗原)限制性腫瘤殺傷能力。
CIK 細胞具有殺瘤活性高、殺瘤譜廣，對正常組織毒性低，體外可高度擴增等特點，是目前
臨床上廣泛使用的過繼性免疫-治療細胞。

【培養(yǎng)原理】
CIK 培養(yǎng)用細胞因子和抗體：
?? CD3 激發(fā)型單抗：

T 細胞活化的*信號來自于T 細胞表面的受體，即T 細胞抗原受體(T cell antigen
receptor, TCR)與APC 提呈的抗原的特異性結(jié)合，也就是T 細胞對抗原的特異性識別。
TCR 是由2 條不同肽鏈構(gòu)成的異二聚體，在T 細胞表面，其與CD3 分子通過非共價鍵
結(jié)合，形成TCR/CD3 復(fù)合體。TCR 識別特異性抗原后會引起CD3 和T 細胞表面的輔助
受體CD4 或CD8 分子的胞漿尾部聚集，進而激活與胞漿尾部相連的酪-氨酸激酶(Lck, Fyn
和ZAP-70 等)，促使CD3 分子胞漿區(qū)的免疫受體酪-氨酸活化基序(immunoreceptor
tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪-氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪-氨酸(pY)進一步
磷酸化下游含酪-氨酸的蛋白，從而引起激酶活化的級聯(lián)反應(yīng)(磷脂酰肌醇途徑或MAP 激
酶途徑等)，zui終通過激活轉(zhuǎn)錄因子，使其進入細胞核內(nèi)，結(jié)合于調(diào)控T 細胞增殖和活
化的靶基因(如IL-2 和IFN-γ等)，引起基因的表達和轉(zhuǎn)錄，T 細胞因而由靜止狀態(tài)轉(zhuǎn)為
增殖和活化狀態(tài)。

由上可見，CD3 分子在T 細胞活化信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著極其關(guān)鍵的作用。CD3 激發(fā)
型單抗與T 細胞表面CD3 分子特異性結(jié)合后，可引起CD3 分子胞漿區(qū)ITAM 基序中酪
-氨酸的磷酸化，進而導(dǎo)致T 細胞增殖和活化的下游信號的激活，從而使T 細胞增殖和活
化。也就是說，CD3 激發(fā)型單抗能夠模擬抗原與TCR/CD3 復(fù)合物的識別和激活過程，
從而引起T 細胞的增殖與活化，因此是CIK 細胞培養(yǎng)中*的刺激因素。

此外，CD3 激發(fā)型單抗在選用時一定要注意克隆號。研究表明，僅克隆號為OKT-3
的CD3 激發(fā)型單抗可以刺激所有人的T 細胞的增殖，而其它克隆號的CD3 激發(fā)型單抗
僅能刺激一部分人的T 細胞。因此，在進行CIK 培養(yǎng)時，選用OKT-3 克隆，以保
證每個患者的T 細胞均能被激活。

?? IL-2 (白細胞介素-2)
IL-2 zui初發(fā)現(xiàn)時被稱為T 細胞生長因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T 細胞
增殖zui重要的細胞因子。IL-2 既是自分泌細胞因子，也是旁分泌細胞因子，其通過與T

細胞表面的IL-2 受體(IL-2R)的特異性結(jié)合而促使T 細胞活化，并進入細胞分裂狀態(tài)。
此外，IL-2 還可刺激NK 細胞的生長并增強其殺傷能力。因此CIK 細胞培養(yǎng)中須添加
IL-2，以促進T 細胞的增殖與活化。
?? IFN-γ (干擾素-γ)
IFN-γ 具有上調(diào)外周血淋巴細胞表面IL-2R表達的作用，因此會增強T細胞對IL-2促
增殖反應(yīng)的敏感度和強度。在誘導(dǎo)CIK細胞形成的過程中加入IFN- γ ，可降低IL-2的用量。
研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ加入的順序與CIK的細胞毒活性密切相關(guān)。先加入IFN- γ，培養(yǎng)24后再
加入IL-2，可明顯提高CIK的細胞毒活性。

?? IL-1α(白細胞介素-1α)
IL-1α也可以介導(dǎo)外周血淋巴細胞表面上調(diào)表達IL-2R。當IL-1α與IFN-γ和激發(fā)型
CD3 單抗合用時，可以明顯提高CIK 的細胞毒作用。

【細胞制備】
1． 外周血單個核細胞的采集
1.1 用血細胞分離機采集患者自身的外周血單個核細胞50-100mL；
1.2 淋巴細胞分離液密度梯度離心法進一步純化單個核細胞(PBMC)；
1.3 無血清培養(yǎng)液洗滌2 次，獲得純度在90%以上的PBMC。

2． CIK 細胞的培養(yǎng)及鑒定
2.1 將PBMC 按1-2 x 106/ml 的濃度懸浮于無血清培養(yǎng)液中，加入1,000 U/ml 的重組
人IFN-γ，37oC，5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
2.2 24h 后加入50ng/ml 的CD3 單克隆抗體和300 U/ml 的重組人IL-2，刺激CIK 細
胞的生長和增殖；
注：此時也可同時加入100 U/ml 的重組人IL-1α。
2.3 每3 天半量換液或擴瓶一次，并補加重組人IL-2 300 U/ml；
2.4 在培養(yǎng)的第14d，收獲CIK 細胞。
2.5 CIK 細胞質(zhì)控：
2.9.1 臺盼藍染色檢測：活細胞應(yīng)在80%以上；
2.9.2 流式細胞儀檢測細胞表面CD3、CD8、CD56 等分子的表達：CD3+CD56+細
胞的比例應(yīng)在20%以上。
2.9.3 細胞殺傷實驗：以CIK 細胞為效應(yīng)細胞，以腫瘤細胞(可為原代腫瘤細胞或
腫瘤細胞株)為靶細胞，將效應(yīng)細胞與靶細胞按10 : 1(數(shù)目比) 的比例加入
96 孔U 型板中，每孔含靶細胞1 x 104 個，終體積為200 μl，設(shè)3 個復(fù)孔。
培養(yǎng)4h，然后取培養(yǎng)上清，用乳酸脫氫酶(LDH) 試劑盒檢測效應(yīng)細胞對靶
細胞的殺傷率。
2.9.4 收獲細胞前，取少量培養(yǎng)物進行細菌、真菌培養(yǎng)，并檢測支原體、衣原體，
及內(nèi)毒素(標準：病原學(xué)檢測陰性，內(nèi)毒素<5 Eu)。